色譜柱可分爲(wéi / wèi)填充柱和(hé / huò)開管柱兩大(dà)類。多爲(wéi / wèi)金屬或玻璃制作。有直管形、盤管形、U形管等形狀。液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的(de)分離效果取決于(yú)所選擇的(de)固定相，以(yǐ)及色譜柱的(de)制備和(hé / huò)操作條件。
1.網上(shàng)對柱子(zǐ)是(shì)否可以(yǐ)反沖一(yī / yì ／yí)直有争論，那什麽樣的(de)柱子(zǐ)可以(yǐ)反沖，什麽不(bù)可以(yǐ)。反沖後是(shì)正着用，還是(shì)反着用。具體到(dào)各型号柱子(zǐ)不(bù)僅是(shì)ODS柱，其他(tā)如，正向柱、氨基柱、離子(zǐ)交換柱等。
答：一(yī / yì ／yí)般的(de)正相反相柱應該都能反沖，隻有兩端篩闆孔徑不(bù)對稱的(de)柱子(zǐ)不(bù)能反沖，不(bù)過目前這(zhè)樣的(de)柱子(zǐ)已經比較少見了(le／liǎo)。反沖是(shì)爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)把柱頭的(de)污染物沖洗掉，反沖後還是(shì)正着用比較好，以(yǐ)免柱子(zǐ)的(de)兩頭都被污染，提倡：正向使用，反向沖洗。
2.對于(yú)一(yī / yì ／yí)根常用的(de)C18柱，拿到(dào)一(yī / yì ／yí)根新柱的(de)時(shí)候應該怎樣進行活化及維護？爲(wéi / wèi)什麽要(yào / yāo)這(zhè)樣做？
答：新柱活化，實際上(shàng)是(shì)一(yī / yì ／yí)個(gè)平衡的(de)過程，除了(le／liǎo)用流動相平衡外，有時(shí)候還必須用所測樣品對新柱進行平衡，特别是(shì)測定分子(zǐ)量比較高的(de)多肽，尤其重要(yào / yāo)。因爲(wéi / wèi)，分子(zǐ)量高的(de)物質分子(zǐ)，擴散速度慢，平衡所需時(shí)間也(yě)相應較長。具體平衡方式也(yě)很簡單，多進幾次樣品，直到(dào)峰面積和(hé / huò)保留時(shí)間穩定，再進行正式進樣測定。
如果要(yào / yāo)加快平衡時(shí)間，把前面用來(lái)平衡的(de)進樣樣品濃度加大(dà)，或者不(bù)等洗脫完成，連續進樣多針。用待測物對新柱平衡，目的(de)是(shì)：将矽膠基質填料表面具有非特異性吸附的(de)位點的(de)吸附能力飽和(hé / huò)掉。
3.氨基柱在(zài)進酸性樣品時(shí)，很傷柱子(zǐ)，如使用一(yī / yì ／yí)段時(shí)間後，柱效降低，峰形改變，如何恢複？
答：氨基柱測酸性樣品，應該是(shì)用氨基柱的(de)HILIC模式。酸的(de)存在(zài)可能會使略帶負電荷的(de)氨基官能團質子(zǐ)化，導緻使用一(yī / yì ／yí)段時(shí)間後對于(yú)某些類的(de)分析物保留性質有所改變或表現在(zài)柱效下降。建議：用5～10倍的(de)柱體積的(de)含0.5～1.0％NH3的(de)乙腈-水(50：50)溶液沖洗該柱（沖洗後當然要(yào / yāo)再用不(bù)含堿的(de)流動相洗去多餘氨），之(zhī)後，再進行分析這(zhè)類酸性分析物時(shí)建議在(zài)流動相中略微添加少許氨如，0.1％。
4.柱子(zǐ)在(zài)什麽情況下可以(yǐ)清洗一(yī / yì ／yí)下篩闆呢？原來(lái)也(yě)讨論過這(zhè)個(gè)問題，有人(rén)也(yě)拆下來(lái)清洗過，但看到(dào)柱前段的(de)污染更甚，于(yú)是(shì)就(jiù)用刀片刮了(le／liǎo)刮，然後把清洗好的(de)篩闆安裝上(shàng)去。問題解決了(le／liǎo)，但使用壽命會不(bù)會減少呢？
答：柱頭污染了(le／liǎo)，就(jiù)取出(chū)污染的(de)，再裝一(yī / yì ／yí)些填料。因爲(wéi / wèi)，假如你刮了(le／liǎo)些填料，那麽微觀的(de)塔闆數就(jiù)少了(le／liǎo)。假如你刮得不(bù)多，僅表面，可能就(jiù)是(shì)一(yī / yì ／yí)些髒物，所以(yǐ)，問題解決，但是(shì)，今後還會有同樣問題，影響柱效。建議還是(shì)裝一(yī / yì ／yí)個(gè)預柱。
5.如果柱子(zǐ)取下來(lái)放置一(yī / yì ／yí)段時(shí)間，需要(yào / yāo)做什麽保護嗎？
答：對一(yī / yì ／yí)般的(de)反相柱，洗幹淨後放到(dào)純甲醇（乙腈）或者是(shì)80%左右的(de)甲醇（乙腈）水中，然後用堵頭塞緊柱兩頭，以(yǐ)免保存溶劑揮發，應該不(bù)需要(yào / yāo)做特殊的(de)保護。
6.流動相中加入适量的(de)四氫呋喃可以(yǐ)改善峰形的(de)機理是(shì)什麽？
答：甲醇爲(wéi / wèi)質子(zǐ)給予體、乙腈爲(wéi / wèi)質子(zǐ)接受體、四氫呋喃是(shì)偶極溶劑，應該除了(le／liǎo)極性影響，還有另外的(de)影響因素，至于(yú)分離機理，還是(shì)比較複雜的(de)，不(bù)能看成是(shì)個(gè)萬能方法。
7.預柱或保護柱用還是(shì)不(bù)用的(de)問題？
答：應該這(zhè)樣說(shuō)，加上(shàng)保護柱，肯定有利于(yú)保護色譜柱不(bù)受一(yī / yì ／yí)些顆粒物質的(de)堵塞，肯定有害于(yú)分離度和(hé / huò)柱效，因爲(wéi / wèi)保護柱中間有着死體積的(de)存在(zài)但是(shì)如果保護柱接得好并且盡量控制其匹配性和(hé / huò)經常更換，分離度和(hé / huò)柱效應該影響并不(bù)大(dà)。頭孢類的(de)抗生素也(yě)要(yào / yāo)看到(dào)底是(shì)原料藥還是(shì)制劑喽，有些原料藥，可以(yǐ)根據色譜柱的(de)損耗選擇添加預柱（中間是(shì)個(gè)篩闆），制劑的(de)話，如果有輔料嚴重幹擾或者流動相鹽分比較大(dà)，那還是(shì)***好配個(gè)保護柱。
8.想請您具體說(shuō)明一(yī / yì ／yí)下反沖色譜柱的(de)方法，是(shì)不(bù)連檢測器嗎？
答：反沖就(jiù)是(shì)将柱子(zǐ)反向連到(dào)系統中。因爲(wéi / wèi)，有污染物反沖出(chū)來(lái)，當然不(bù)連檢測器，出(chū)液端直接接到(dào)廢液瓶就(jiù)可以(yǐ)。
9.waters，AtlantisC18柱可以(yǐ)用較高比例的(de)流動相，那麽用完後應該怎麽清洗？在(zài)什麽體系中保存比較合适？
答：反相柱都可以(yǐ)用下面通用的(de)方法清洗維護：
流動相中不(bù)含緩沖鹽：分析完成後，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min
流動相中含有緩沖鹽：分析完成後，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向沖洗45min，然後再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易長菌，使用時(shí)間不(bù)可超過3天）；
水性柱保存體系也(yě)不(bù)特别：
短期保存在(zài)所用的(de)流動相中（不(bù)含緩沖鹽），中長期保存在(zài)純甲醇（乙腈）或80%的(de)甲醇（乙腈）/水中。
10.正相矽膠柱一(yī / yì ／yí)般保存在(zài)什麽溶劑裏面比較合适？
答：短期和(hé / huò)長期都建議保存在(zài)正相測定所用的(de)流動相中，一(yī / yì ／yí)般是(shì)正己烷和(hé / huò)極少量的(de)異丙醇。
11.多個(gè)樣品不(bù)好分離的(de)時(shí)候，請問該怎麽通過選擇合适的(de)柱子(zǐ)來(lái)提高分離度？
答：提高分離度可從三個(gè)主要(yào / yāo)影響因素來(lái)考慮，柱效、選擇性和(hé / huò)保留因子(zǐ)。可通過減小填料粒徑和(hé / huò)增加柱長提高柱效；選擇性和(hé / huò)固定相選擇以(yǐ)及pH條件有關，通過選擇合适的(de)色譜柱和(hé / huò)合适的(de)pH，可以(yǐ)提高選擇性；有時(shí)候适當延長出(chū)峰時(shí)間增加保留因子(zǐ)，也(yě)可提高分離度。
12.我們測試樣品時(shí)，經常會關心柱壓是(shì)否太高，但是(shì)在(zài)購買色譜柱時(shí)，并沒有說(shuō)每一(yī / yì ／yí)根色譜柱的(de)***大(dà)使用壓力是(shì)多少？針對這(zhè)樣的(de)情況，用戶怎麽判斷柱壓是(shì)否超過該柱的(de)極限？
答：裝柱時(shí)的(de)壓力比使用時(shí)高很多，所以(yǐ)柱壓對色譜柱本身在(zài)使用時(shí)沒有極限問題存在(zài)，倒是(shì)一(yī / yì ／yí)般儀器有個(gè)40Mpa的(de)上(shàng)限。如果色譜分離度還能滿足分析方法要(yào / yāo)求，柱壓隻要(yào / yāo)儀器能承受就(jiù)OK吧。
13.不(bù)知道(dào)流動相已走完，液相色譜柱空走了(le／liǎo)大(dà)概一(yī / yì ／yí)晚上(shàng)，請問這(zhè)種情況下柱子(zǐ)還能用嗎？如果可以(yǐ)應該如何再生？
答：能用的(de)！可能柱子(zǐ)裏會有氣泡進去，但隻要(yào / yāo)多用流動相沖沖，看到(dào)基線穩定，就(jiù)沒問題了(le／liǎo)。用色譜柱的(de)保存液低流速長時(shí)間沖洗，然後，再檢測一(yī / yì ／yí)下柱效，看柱子(zǐ)是(shì)否恢複，液相***好設置一(yī / yì ／yí)下***低壓限，這(zhè)樣就(jiù)不(bù)怕流動相***而(ér)會損傷色譜柱。
14.在(zài)梯度洗脫的(de)時(shí)候，如果整個(gè)時(shí)間程序越長，保留時(shí)間的(de)重現性越差，尤其是(shì)後出(chū)的(de)峰重現性差更明顯，怎麽盡量避免這(zhè)種情況的(de)出(chū)現，使保留時(shí)間重現性更好？
答：這(zhè)個(gè)要(yào / yāo)控制好環境溫度和(hé / huò)柱溫，易揮發的(de)流動相要(yào / yāo)适當密封，同時(shí)，保留時(shí)間的(de)漂移與儀器的(de)精度也(yě)有關系。
15.一(yī / yì ／yí)般正常使用一(yī / yì ／yí)個(gè)C18柱能用多長時(shí)間？
答：柱壽命一(yī / yì ／yí)般不(bù)按時(shí)間計算，按持續進樣針數比較科學。一(yī / yì ／yí)般正常使用維護，不(bù)超過pH和(hé / huò)溫度等範圍，C18柱能達到(dào)500～2000針進樣的(de)壽命，視樣品幹淨程度的(de)不(bù)同而(ér)不(bù)同。
16.請問怎麽測柱效？（柱子(zǐ)填料是(shì)SinoChromODS-BP5μm，規格4.6mm×200mm）
答：測定柱效不(bù)同公司不(bù)一(yī / yì ／yí)樣，有用甲苯，也(yě)有用萘的(de)。一(yī / yì ／yí)般柱子(zǐ)裏面有檢測報告，你按照報告裏的(de)方法做一(yī / yì ／yí)遍就(jiù)可以(yǐ)。
17.峰形後拖尾是(shì)什麽原因造成的(de)？
答：[柱物理損壞]色譜柱有物理損壞是(shì)造成峰形拖尾的(de)根源。***的(de)解決方法就(jiù)是(shì)更換新柱。
[柱内填料污染]流動相和(hé / huò)樣品中的(de)雜質是(shì)色譜柱主要(yào / yāo)污染源。流動相所用的(de)各種溶劑至少是(shì)分析純，盡量使用色譜純試劑。流動相所用的(de)水***好是(shì)超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45μm溶劑微孔過濾（器）過濾，除去可能存在(zài)的(de)微粒。流動相建議現用現配，對于(yú)含鹽的(de)溶液尤其注意長置會産生細菌或出(chū)現沉澱。此外還得保證儲存流動相的(de)容器清潔。複雜樣品可選用0.45μm溶劑微孔過濾（器）或樣品預處理柱對樣品進行預處理，确保樣品中不(bù)含微粒雜質。若樣品不(bù)便處理，要(yào / yāo)使用保護柱。柱内填料污染時(shí)，可将柱頭螺絲卸下，用專用工具挖出(chū)柱内前段被污染填料，再以(yǐ)相同的(de)填料重新填入，修複，或以(yǐ)能溶解污染物的(de)流動相按色譜柱使用的(de)相反方向，沖洗色譜柱（約20至30倍柱體積，或視具體情況而(ér)定；另外，此時(shí)不(bù)能接檢測器），将污染物沖出(chū)色譜柱，再按色譜柱标明的(de)使用方向使用。
[柱進口處有異物]
當斷定是(shì)柱進口處有異物時(shí)，可将柱頭螺絲卸下，取出(chū)濾帽并将其置于(yú)20%硝酸溶液中，用超聲波清洗約20分鍾，再置于(yú)超純水中，并用超聲波清洗約10分鍾，重新裝入色譜柱内即可。
[樣品濃度過高緻使柱超載]
樣品在(zài)柱上(shàng)超載能引起峰展寬，拖尾（或伸舌）。
适當減小進樣量或樣品濃度（需要(yào / yāo)時(shí)，可提高檢測器靈敏度）直至峰形和(hé / huò)保留時(shí)間不(bù)再改變，便可消除這(zhè)種不(bù)良影響。減小進樣量還能改善其分離度。正常情況下，樣品中每種化合物在(zài)150×4.6mm柱中進樣量保持在(zài)3～50μg範圍内，不(bù)會引起明顯超載。
[樣品溶劑不(bù)對]
選擇合适的(de)樣品溶劑，以(yǐ)排除不(bù)必要(yào / yāo)的(de)幹擾，***好選用流動相溶解樣品。
[柱外效應]
柱外效應（即，進樣閥、色譜柱及檢測器間的(de)管路過長、直徑過粗、管路接頭不(bù)匹配、有死體積）是(shì)影響色譜柱柱效的(de)主要(yào / yāo)因素之(zhī)一(yī / yì ／yí)，所以(yǐ)，在(zài)可能的(de)條件下，色譜柱的(de)兩端連接管路要(yào / yāo)盡可能短，連接管内徑盡可能細小，切口務必平整光滑，盡可能的(de)減小死體積，以(yǐ)防止因樣品擴散造成不(bù)能反映色譜柱真實柱效等情況發生。
[緩沖不(bù)足或不(bù)合适]
在(zài)緩沖不(bù)好或離子(zǐ)強度過低的(de)分離中，也(yě)會出(chū)現保留時(shí)間重現性差和(hé / huò)峰形拖尾。增加緩沖濃度（與樣品大(dà)小相匹配）能改善此情況。
[矽醇基團作用]仔細分析色譜柱内填料表面性質可知：反相色譜柱填料的(de)表面大(dà)約被鍵合相覆蓋了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)半，其餘的(de)就(jiù)是(shì)未被鍵合的(de)矽醇基團。所謂的(de)保留是(shì)指樣品分子(zǐ)與鍵合相相互作用的(de)結果。但是(shì)，酸性或堿性化合物與矽膠表面殘存的(de)矽醇基團或金屬雜質之(zhī)間相互作用而(ér)引起雙重保留機理，因此，發生了(le／liǎo)峰形拖尾。
爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)減小峰形拖尾，通常可在(zài)流動相加入25mM三乙胺（抑制劑）。三乙胺能與矽醇基團發生強烈的(de)相互作用，從而(ér)降低或阻斷樣品分子(zǐ)與矽醇基團的(de)作用，以(yǐ)保證保留機理正常進行，并大(dà)大(dà)緩解了(le／liǎo)峰形拖尾。使用長鏈的(de)矽醇基抑制劑，雖起效較慢，但，持續力較三乙胺長。因爲(wéi / wèi)抑制劑分子(zǐ)中除了(le／liǎo)胺基與矽醇基團發生極性作用外，大(dà)分子(zǐ)中非極性部分與固定相也(yě)會發生反相作用而(ér)産生保留現象。如果，将抑制劑加至樣品中，效果會顯著。
[柱内金屬污染]
柱内金屬污染（Fe，Ni等）可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進，也(yě)可由腐蝕性流動相緩慢溶解柱進口的(de)金屬濾片，随流動相沉積到(dào)柱填料中，例如，C18柱填料被金屬污染後，造成酸性/堿性樣品拖尾，可用堿洗/酸洗後再鍵合的(de)填料，得到(dào)的(de)峰是(shì)尖銳且對稱的(de)。
18.哪些原因會造成色譜峰變寬、峰高變低，有哪些解決辦法？
答：确實是(shì)這(zhè)樣，如果其它色譜條件沒有改變，柱效下降是(shì)導緻峰變寬的(de)主要(yào / yāo)原因。對于(yú)易電離的(de)極性物質，如果流動相pH選擇不(bù)合适，分析物既有中性分子(zǐ)态存在(zài)，又有離子(zǐ)态存在(zài)，峰也(yě)會變寬變矮。
色譜柱使用後柱效逐步下降是(shì)正常現象，如突然降低則屬異常。柱效下降原因有很多，但柱效快速下降則多半是(shì)使用不(bù)當，造成填料特性或柱床結構改變所緻。如超過使用pH範圍造成的(de)固定相和(hé / huò)矽膠基體的(de)流失、柱床塌陷等；還有強保留物質吸附在(zài)填料表面，形成非特異性吸附層，完全改變了(le／liǎo)原有固定相的(de)表面活性和(hé / huò)分離性能，使柱效下降；另外進樣時(shí)的(de)壓力脈沖，也(yě)會破壞柱床結構影響柱效。
參考文獻來(lái)源于(yú)：制藥微生物檢測。
質量控制部
2019年08月02日
